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  3. 下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是

下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是

admin2015-08-15  50
问题 下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是
选项 A、等电聚焦电泳
B、SDS-PAGE电泳
C、凝胶过滤层析
D、亲和层析
E、区带离心
答案A
解析 (1)根据分子大小的纯化方法：
    ① 透析和超滤透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质与无机盐、糖等小分子相分离，常用于蛋白质浓缩和脱盐。
    ②离心：离心是利用蛋白质分子的质量或密度不同而进行分离的方法。在离心场中，蛋白质分子的运动取决于它的密度和形状，沉降系数可以精确地描述其运动特征。利用蔗糖密度梯度离心，可以将混合物分成若干区带，区带中的物质(蛋白质或细胞器)的密度和这一位置的蔗糖密度相当。超速离心获得的离心力可以是重力加速度(g)的6×105倍，超速离心机产生的离心力足以沉淀质量大于10000的微粒。为了降低高速离心产生的高温，离心机转头所在的空间必须高度真空。
    ③凝胶过滤层析：又称“分子排阻层析”或“分子筛”。凝胶颗粒呈多孔的网状结构，较大的蛋白质分子不能进入孔，只能从颗粒间的缝隙通过，首先洗脱出来；而较小的蛋白质能够进入并穿过孔，路径长，洗脱速度慢。目前经常使用的凝胶有葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。
    (2)利用溶解度差别的纯化方法：
    ① 等电点沉淀：蛋白质处于等电点时，同类分子之间的静电斥力消除，因而发生聚集、沉淀。调节蛋白质混合物的pH，如达到某一成分的pI，则这种蛋白质将沉淀，其他蛋白质保留于上清。
    ②盐析：在蛋白质混合物中大量加入硫酸钠、氯化钠等中性盐，原来作为溶剂的大部分水变成盐离子的水化水，迫使蛋白质的疏水基团暴露出来，蛋白质因疏水作用而聚集、沉淀，最先沉淀的应当是表面疏水基团最多的蛋白质。另外，利用与水互溶的有机溶剂(丙酮、乙醇等)可以使蛋白质在低温下沉淀；在低温下控制温度能够使蛋白质分级沉淀，因为大部分球蛋白的溶解度随温度的升高而增加。
    (3)根据电荷不同的纯化方法：
    ① 电泳：带电颗粒(蛋白质、核酸等)携带的净电荷不同，在电场中向其电性相反的电极移动。根据支持物的不同，电泳分为薄膜电泳、凝胶电泳等。凝胶电泳常用的支持物有琼脂糖和聚丙烯酰胺等。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的分辨率较高，可以将人血清蛋白质分成几十条区带。SDS-PAGE可以分离蛋白质混合物，并且测定蛋白质的相对分子质量。SDS(十二烷基硫酸钠)携带的负电荷比蛋白质的电荷多10倍以上。蛋白质混合物经过SDS处理以后，不仅使蛋白质变性，而且基本上消除了各组分在电荷和形状方面的差异，多肽链的质量成为决定其迁移速度的唯一因素。等电聚焦(IEF)的原理是：在聚丙烯酰胺凝胶中含有两性电解质形成的连续的线性pH梯度，不同的蛋白质将分别“聚焦”在相当于各自pI的位置停止前进，形成一条条狭窄的区带。IEF的分辨率较高，可以分离pI相差0．01pH单位的蛋白质。双向电泳的大致步骤为：首先蛋白质混合物进行IEF，按pI的不同进行分离，然后将凝胶条取出进行SDS-PAGE，电泳方向与IEF垂直，使蛋白质再根据相对分子质量大小分离。双向电泳的优点是分辨率很高，重复性好，可研究细胞蛋白质表达谱。毛细管电泳在内径很细的石英管中进行，以利于散热，其特点是高效、快速和微量。
    ②离子交换层析：以离子交换树脂作为固定相，其表面含有修饰基团，在中性pH条件下这些基团携带电荷，吸引携带相反电荷的蛋白质分子。利用盐离子浓度梯度，可以将吸附于树脂的蛋白质有选择地洗脱下来。高效液相层析(HPLC)的树脂颗粒很细(直径只有普通树脂的几十分之一)，流动相必须借助于高压泵才能获得正常流速，因此大大增加了交换面积，提高了分离效率，分辨率高。所有经典的液相层析均可通过HPIC进行，例如离子交换、凝胶过滤和亲和层析等。
    (4)利用对配体的生物亲和力的纯化方法：亲和层析根据蛋白质的生物学特异性(对配体的亲和力)进行分离。如果将抗体(或酶的底物)作为配体共价连接在树脂上，就能使相应的抗原(或者特异的酶蛋白)吸附于亲和层析柱上，而蛋白质混合物中的其他蛋白不能吸附。含有过量配体的洗脱液可以将吸附于层析柱的蛋白质洗脱下来。
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