2. 医学
  3. 假定你决定从一种新的生物Streptococcus bartelium体内纯化核糖核酸酶，你选择盐析作为纯化的第一步，随后你添加硫酸铵到细胞裂解物之中，进行分级分离。若你添加的盐浓度为0．5 mol／L、1 mol／L、1．5 mol／L、2 mol／L和

假定你决定从一种新的生物Streptococcus bartelium体内纯化核糖核酸酶，你选择盐析作为纯化的第一步，随后你添加硫酸铵到细胞裂解物之中，进行分级分离。若你添加的盐浓度为0．5 mol／L、1 mol／L、1．5 mol／L、2 mol／L和

admin2019-08-28  45
问题 假定你决定从一种新的生物Streptococcus bartelium体内纯化核糖核酸酶，你选择盐析作为纯化的第一步，随后你添加硫酸铵到细胞裂解物之中，进行分级分离。若你添加的盐浓度为0．5 mol／L、1 mol／L、1．5 mol／L、2 mol／L和2．5 mol／L，(1)那么将如何确定你要的蛋白质在哪一级分离沉淀之中?(2)若你选择离子交换层析作为纯化核糖核酸酶的第二步，同样需要确定哪一部分含有目标蛋白。你会使用哪一种离子交换树脂?为什么?如何从交换树脂中洗脱下你的目标蛋白?(3)把纯化的蛋白质走SDS-PAGE，在考马斯亮蓝染色以后，你看到一条单一的35×103大小的条带。为了确定它是不是核糖核酸酶，你决定将条带切下，然后测序。然而，你吃惊的发现，这种蛋白质是一种核糖体蛋白，于是你决定再进行一次蛋白质染色，这一次你发现了一条75 × 103大小的条带。这一次染色方法是什么?显示出新的条带的原因是什么?你如何分离这两种蛋白质?
选项
答案(1)在纯化蛋白质过程中，首先需要建立一种测定活性的方法。测定核糖核酸酶活性的方法是利用其将RNA降解成单个核苷酸，使用放射性标记的NTP，可转录出带放射性标记的RNA，以此作为核糖核酸酶的底物，将其与含有酶的部分保温，然后用TCA沉淀，再使用特定的滤膜过滤，通过测定流过滤膜的带有同位素标记的核苷酸的放射性，可测定出纯化物中酶活性的高低。 (2)既然核糖核酸酶的底物是磷酸核糖骨架带负电荷的RNA，核糖核酸酶本身可能带正电荷。所以，可考虑阳离子替换树脂来纯化核糖核酸酶。在低盐浓度下上柱，吸附核糖核酸酶，然后用高盐缓冲液洗脱出核糖核酸酶。 (3)考马斯亮蓝染色的灵敏度仅能检测出含有大约100 ng的条带，而银染的灵敏度达10 ng。所以使用考马斯亮蓝染色看不到的条带有可能通过银染看到。为了将35×103的核糖体蛋白与75×103的核糖核酸酶分开，可使用凝胶过滤层析。75×103的核糖核酸酶应该先被洗脱出来。
解析
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