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医学
下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是
下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是
admin
2022-08-17
27
问题
下列蛋白质分离纯化方法中以净电荷不同为依据的是
选项
A、等电聚焦电泳
B、SDS-PAGE电泳
C、凝胶过滤层析
D、亲和层析
E、区带离心
答案
A
解析
(1)根据分子大小的纯化方法:①透析和超滤透析和超滤:利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质与无机盐、糖等小分子相分离,常用于蛋白质浓缩和脱盐。②离心:离心是利用蛋白质分子的质量或密度不同而进行分离的方法。在离心场中,蛋白质分子的运动取决于它的密度和形状,沉降系数可以精确地描述其运动特征。利用蔗糖密度梯度离心,可以将混合物分成若干区带,区带中的物质(蛋白质或细胞器)的密度和这一位置的蔗糖密度相当。超速离心获得的离心力可以是重力加速度(g)的6×10
5
倍,超速离心机产生的离心力足以沉淀质量大于10000的微粒。为了降低高速离心产生的高温,离心机转头所在的空间必须高度真空。③凝胶过滤层析:又称“分子排阻层析”或“分子筛”。凝胶颗粒呈多孔的网状结构,较大的蛋白质分子不能进入孔,只能从颗粒间的缝隙通过,首先洗脱出来;而较小的蛋白质能够进入并穿过孔,路径长,洗脱速度慢。目前经常使用的凝胶有葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。(2)利用溶解度差别的纯化方法:①等电点沉淀:蛋白质处于等电点时,同类分子之间的静电斥力消除,因而发生聚集、沉淀。调节蛋白质混合物的pH,如达到某一成分的pI,则这种蛋白质将沉淀,其他蛋白质保留于上清。②盐析:在蛋白质混合物中大量加入硫酸钠、氯化钠等中性盐,原来作为溶剂的大部分水变成盐离子的水化水,迫使蛋白质的疏水基团暴露出来,蛋白质因疏水作用而聚集、沉淀,最先沉淀的应当是表面疏水基团最多的蛋白质。另外,利用与水互溶的有机溶剂(丙酮、乙醇等)可以使蛋白质在低温下沉淀;在低温下控制温度能够使蛋白质分级沉淀,因为大部分球蛋白的溶解度随温度的升高而增加。(3)根据电荷不同的纯化方法:①电泳:带电颗粒(蛋白质、核酸等)携带的净电荷不同,在电场中向其电性相反的电极移动。根据支持物的不同,电泳分为薄膜电泳、凝胶电泳等。凝胶电泳常用的支持物有琼脂糖和聚丙烯酰胺等。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的分辨率较高,可以将人血清蛋白质分成几十条区带。SDS-PAGE可以分离蛋白质混合物,并且测定蛋白质的相对分子质量。SDS(十二烷基硫酸钠)携带的负电荷比蛋白质的电荷多10倍以上。蛋白质混合物经过SDS处理以后,不仅使蛋白质变性,而且基本上消除了各组分在电荷和形状方面的差异,多肽链的质量成为决定其迁移速度的唯一因素。等电聚焦(IEF)的原理是:在聚丙烯酰胺凝胶中含有两性电解质形成的连续的线性pH梯度,不同的蛋白质将分别“聚焦”在相当于各自pI的位置停止前进,形成一条条狭窄的区带。IEF的分辨率较高,可以分离pI相差0.01pH单位的蛋白质。双向电泳的大致步骤为:首先蛋白质混合物进行IEF,按pI的不同进行分离,然后将凝胶条取出进行SDS-PAGE,电泳方向与IEF垂直,使蛋白质再根据相对分子质量大小分离。双向电泳的优点是分辨率很高,重复性好,可研究细胞蛋白质表达谱。毛细管电泳在内径很细的石英管中进行,以利于散热,其特点是高效、快速和微量。②离子交换层析:以离子交换树脂作为固定相,其表面含有修饰基团,在中性pH条件下这些基团携带电荷,吸引携带相反电荷的蛋白质分子。利用盐离子浓度梯度,可以将吸附于树脂的蛋白质有选择地洗脱下来。高效液相层析(HPLC)的树脂颗粒很细(直径只有普通树脂的几十分之一),流动相必须借助于高压泵才能获得正常流速,因此大大增加了交换面积,提高了分离效率,分辨率高。所有经典的液相层析均可通过HPIC进行,例如离子交换、凝胶过滤和亲和层析等。(4)利用对配体的生物亲和力的纯化方法:亲和层析根据蛋白质的生物学特异性(对配体的亲和力)进行分离。如果将抗体(或酶的底物)作为配体共价连接在树脂上,就能使相应的抗原(或者特异的酶蛋白)吸附于亲和层析柱上,而蛋白质混合物中的其他蛋白不能吸附。含有过量配体的洗脱液可以将吸附于层析柱的蛋白质洗脱下来。
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